VWF免疫組化

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。VWF免疫組化

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘。12.95%甘油封片。注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。r-H2AX免疫組化IHC使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實驗技術(shù)，用于檢測和定位特定抗原或抗體。VWF免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。VWF免疫組化

免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會產(chǎn)生背景熒光，對結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前，應(yīng)對樣品進(jìn)行觀察，確?？乖旧頉]有信號。2、陽性對照：用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細(xì)胞，與待測標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理，結(jié)果應(yīng)為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。VWF免疫組化