P21免疫熒光分析

熒光抗體技術：抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術可以用于研究病毒傳播和免疫應答。P21免疫熒光分析

免疫熒光的原理：免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。直接法:將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。HIF-1a免疫熒光檢查免疫熒光技術可以用于研究免疫相關疾病和自身免疫病。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。2）每次試驗時，需設置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標記物②陰性對照：陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如亞甲藍、堿性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質，使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質的高度發(fā)達的標記免疫技術。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結果背景較高可以延長漂洗的次數和時。免疫熒光技術可以用于研究細胞遷移和細胞黏附。HIF-1a免疫熒光檢查

免疫熒光技術在生物學研究、醫(yī)學診斷和藥物開發(fā)等領域具有普遍應用。P21免疫熒光分析

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍，可以測定內分泌、蛋白質、細胞因子、細胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經遞質、肉瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質。根據診斷類別，又可分為傳染性疾病、內分泌、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察。P21免疫熒光分析

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