海洋生物外泌體lncRNA芯片

雖然外泌體在疾病的診斷上有天然優(yōu)勢，但在臨床應用上仍有一些限制：外泌體的提取方法金標準仍然是差速離心法，但這種方法費時費力且提取效率較低，難以進行臨床推廣和應用；而商業(yè)化的試劑盒質(zhì)量參差不齊，往往導致提取物雜質(zhì)過多，且其售價較高。外泌體的定量是采用顆粒濃度定量，蛋白濃度定量，亦或是核酸濃度定量，目前仍存有爭議。由于傳統(tǒng)的內(nèi)參并不適用于外泌體，在實時熒光定量PCR檢測靶分子含量時內(nèi)參的選擇尚沒有統(tǒng)一的標準。外泌體分子標志物的研究還處于初級階段。目前外泌體研究的整個流程中成本都很高。從外泌體中篩選的生物標志物，可用于疾病的診斷、預后及治理。海洋生物外泌體lncRNA芯片

尺寸排除色譜法是使用聚合物凝膠或類似的固定相柱進行外泌體分離的技術,樣品以重力滴落的方式收集。流體力學半徑較小的樣品組分進入凝膠孔隙后,需耗費相對較長的時間通過凝膠柱,導致延遲洗脫,實現(xiàn)不同粒徑大小顆粒分離。尺寸排除色譜法可以與差速離心法結(jié)合而不會明顯損失外泌體,保證產(chǎn)量的同時可有效去除雜質(zhì)蛋白,更適合目標蛋白質(zhì)組學和miRNA的分析。靜水過濾透析法主要利用靜水壓力迫使樣品中不同特定大小分子先后通過透析管,其中溶劑和小溶質(zhì)很容易通過透析管,而較大的顆粒,如外泌體和其他囊泡,仍留在透析管中而被收集。江蘇干細胞外泌體不同肝臟疾病中，細胞分泌的外泌體所攜帶的核酸和蛋白組分之間存在差異。

Vlassov等人發(fā)表的一篇外泌體的提取方法及組成的專利文獻中介紹，通過終濃度為8%的PEG6000與生物體液共孵育14h后，10000xg離心1h，可將直徑在30-150nm之間，且包含豐富RNA的外泌體沉淀下來。因此采用終濃度為8%的PEG6000沉淀血清中的外泌體，為了進一步純化胎盤相關外泌體，將獲得的包含外泌體的沉淀用PBS重新懸浮后，加入非線性蔗糖密度梯度層，10000xg超速離心5h，將分層液采用PEG6000進行2次沉淀。經(jīng)過多次實驗反復驗證，確定同時表達外泌體標志蛋白分子及胎盤特異性蛋白分子的胎盤來源外泌體所在密度層。

外泌體mirRNA和蛋白質(zhì)被認為是NSCLC的預后因子。Dejima等在研究NSCLC患者預后的生物標志物時發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-4257和miR-21的含量顯著上升。此外，還有研究表明，低水平miR-146a-5p的NSCLC患者較高水平miR-146a-5p的NSCLC患者有更高的復發(fā)率。Sandfeld-Paulsen等在研究276例NSCLC患者血漿的外泌體時發(fā)現(xiàn)，NY-ESO-1是單獨對低生存率有顯著影響的標志物。Silva等利用TaqMan低密度芯片的方法系統(tǒng)分析了28位NSCLC患者體內(nèi)的365種miRNA，其中l(wèi)et-7f、miR-30e-3p和miR-20b表達均下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，let-7f和miR-30e-3p水平可以區(qū)分早期和晚期NSCLC患者，高水平let-7f和miR-30e-3p與不良預后密切相關。外泌體天然的可以攜帶遺傳到靶細胞中，從而在生物學和致病過程中誘導遺傳修飾。

結(jié)果表明，PS親和法可以檢測到許多目前為止都無法檢測的外泌體蛋白質(zhì)和RNA。應用Tim4的外泌體強結(jié)合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度定性檢測、定量分析外泌體。以前無法用超速離心法提取的微囊泡，也通過運用PS親和法實現(xiàn)高純度提取。本指導書中對該技術進行詳細說明，這項技術的有用性今后將受到世界各方評價，有望在外泌體和微囊泡生理功能的分析研究上起重大貢獻。外泌體的檢測和提取還遇到一個困難即：對各種外泌體的分類。研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法提取的細胞外囊泡可以稱之為外泌體，給實驗數(shù)據(jù)的分析和重復性確認帶來困難。近年，隨著國際細胞外囊泡協(xié)會的成立、世界性研究者研討會的舉辦，提案MISEV指南作為國際標準，計劃或已經(jīng)開始進行EV研究的科學家請務必閱讀這些方針。以前無法用超速離心法提取的微囊泡，也通過運用PS親和法實現(xiàn)高純度提取。nk細胞外泌體

外泌體是內(nèi)源性和質(zhì)膜起源的不同類型的膜囊泡。海洋生物外泌體lncRNA芯片

隨著科學研究的不斷深入，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體是由通過細胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成多泡內(nèi)涵體，多泡內(nèi)涵體再與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的一種直徑約30~120nm的膜性囊泡。外泌體介導瘤細胞的化療抵抗。在瘤的治理過程中經(jīng)常會出現(xiàn)藥物耐受的情況，這會導致化療失敗，在這和過程中外泌體以多種途徑參與了化療抵抗這一過程。通常，發(fā)生EMT過程的瘤細胞可獲得抵抗凋亡能力，而抵抗凋亡通常使瘤表現(xiàn)為化療抵抗。瘤細胞來源的外泌體能通過傳遞相關的組織因子(如VEGF、TGF2β)介導細胞發(fā)生EMT，從而增加瘤細胞的化療抵抗能力。海洋生物外泌體lncRNA芯片